Anaerobe Kulturausrüstung in der Mikrobiomforschung

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Anaerobe Kulturausrüstung in der Mikrobiomforschung

Veränderte Anforderungen an anaerobe Kulturgeräte in der Mikrobiomforschung und Produktentwicklung

 Louis Pasteur wies in den 1860er Jahren überzeugend nach, dass bestimmte Organismen (die heute als Bakterien bekannt sind) in Abwesenheit von Sauerstoff besser wachsen. Die katalytische Entfernung von Sauerstoff aus der Inkubationsatmosphäre, die das Oberflächenwachstum von Bakterien auf Agarplatten in einem anaeroben Gefäß ermöglichte, wurde in den 1910er bis 20er Jahren entwickelt, und eine weitere Verfeinerung der anaeroben Kultivierungstechniken, die die Kultivierung der anspruchsvollsten Anaerobier ermöglichte, folgte. In den 1940er Jahren ermöglichte Robert Hungate mit seiner Technik die Kultivierung von streng anaeroben zelluloseabbauenden Bakterien aus dem Rinderpansen in mit Gummistopfen verschlossenen Kulturröhrchen mit Agar-Nährmedium, eine Technik, die auch heute noch verwendet wird. In den 60er und 70er Jahren wurden verbesserte Technologien entwickelt, wie z. B. anaerobe gaserzeugende Beutel zur Verwendung in anaeroben Gefäßen, gefolgt von den ersten anaeroben Gloveboxen, womit die für sauerstofffreie Bakterienkulturen erforderlichen Geräte und Verfahren erheblich vereinfacht wurden. 

Die im 21. Jahrhundert entwickelten metagenomischen Ansätze zeigten jedoch, dass der größte Teil der mikrobiellen Biodiversität, einschließlich derjenigen des menschlichen Darmtrakts, nicht kultivierbar blieb.  Dies gab den Anstoß zu weiteren Entwicklungen bei bakteriellen Kulturmedien und Inkubationstechniken, die zum Bereich der Culturomics beigetragen haben: ein Hochdurchsatzverfahren, das mehrere gleichzeitige Kulturbedingungen, verlängerte Inkubationszeiten und Techniken wie die MALDI-TOF-Spektrometrie und die 16S rRNA-Gen-Sequenzierung zur Identifizierung bisher nicht kultivierbarer Bakterienarten verwendet.  Da ein großer Teil dieser bisher " nicht kultivierbaren " Arten streng sauerstofffreie Wachstumsbedingungen benötigt, ist es notwendig geworden, genomische und culturomics-Techniken mit anaerober Inkubation zu kombinieren, was Änderungen in der Gestaltung von anaeroben Arbeitsstationen erforderlich macht, um die erforderliche Ausrüstung unterzubringen.

Als Don Whitley Scientific (DWS) 1980 seine erste anaerobe Arbeitsstation auf den Markt brachte, war sie in erster Linie für klinisch-mikrobiologische Laboratorien bestimmt, wo sie dazu beitrug, die Isolierungsraten von Anaerobiern aus Patientenproben zu verbessern, den Probendurchsatz zu erhöhen und bessere klinische Ergebnisse bei anaeroben Infektionen zu erzielen. Zu dieser Zeit galt die anaerobe Bakteriologie noch als recht spezialisiert und erforderte relativ aufwändige Verfahren. Die wichtigste Methode zur Herstellung einer anaeroben Inkubationsatmosphäre war der Anaerobentopf, der nach dem Prinzip des Evakuierens und Austauschens hergestellt wurde und sich am besten für Arbeiten in relativ kleinem Maßstab eignete (Kultivierung von Bakterien auf einer kleinen Anzahl von Agarplatten). Seit den 1980er Jahren bis in die 2010er Jahre wurden die meisten anaeroben und mikroaeroben Arbeitsstationen in klinischen Laboratorien auf der ganzen Welt installiert, um die Diagnose von Krankheiten zu erleichtern, die durch anaerobe Krankheitserreger wie Clostridium, Bacteroides und Fusobacterium und mikroaerophile Keime wie Campylobacter und Helicobacter verursacht werden.

Während die klinische Mikrobiologie nach wie vor einen bedeutenden Markt für Arbeitsstationen mit Schutzatmosphäre darstellt, nimmt die Zahl der an Forschungs- und Entwicklungslaboratorien verkauften Geräte jedes Jahr zu. Das Marktsegment, in dem wir den größten Zuwachs verzeichnen konnten, ist die Forschung im Zusammenhang mit dem menschlichen Darmmikrobiom und seiner Rolle für die menschliche Gesundheit. Das Mikrobiom umfasst nicht nur Hunderte von Mikrobenarten, sondern auch Hunderte von Stoffwechselprodukten, die die Bakterien aufnehmen und ausscheiden. Durch die Syntrophie vermitteln diese Stoffwechselprodukte Interaktionen zwischen den Arten und haben direkte Auswirkungen auf den Wirt. Einrichtungen wie das Rowett Institute, Aberdeen, können diese Prozesse jetzt unter geeigneten physiologischen Bedingungen untersuchen: Dies wurde durch die neueste Generation größerer anaerober Arbeitsstationen ermöglicht, die Platz für die Geräte bieten, die für solche Studien benötigt werden. Eine häufige Anforderung ist der Betrieb eines automatisierten Mikrotiterplatten-Lesegeräts unter anaeroben Bedingungen, damit der Einfluss der Substratverfügbarkeit auf die Wachstumsrate von Darmbakterien mit mehreren Bakterienarten und/oder Substraten gleichzeitig bestimmt werden kann. Andere Forschungsgruppen verwenden Zellsortierer wie den BioRad S3e und BD FACSMelody™.  Jedes dieser Geräte kann in einer anaeroben DWS-Arbeitsstation mit größerer Höhe und Tiefe untergebracht werden als die in der klinischen Mikrobiologie üblicherweise verwendeten Modelle.

Der andere wichtige Bereich der mikrobiombezogenen Forschung ist die Entwicklung von therapeutischen Produkten. In den letzten zehn Jahren ist eine Vielzahl neuartiger Therapien entstanden, die lebende Mikroorganismen als Wirkstoffe enthalten und darauf abzielen, Krankheiten beim Menschen zu behandeln, zu verhindern oder zu heilen. Die prototypische Mikrobiom-Therapie ist die fäkale Mikrobiota-Transplantation (FMT), die hauptsächlich zur Behandlung von rezidivierenden Clostridioides-difficile-Infektionen (rCDI) in Verbindung mit Durchfall und pseudomembranöser Kolitis eingesetzt wird und erstmals in den 1950er Jahren in der westlichen Medizin beschrieben wurde. In ihrer einfachsten Form, bei der dem Patienten homogenisiertes, frisches Fäkalienmaterial eines gesunden Spenders verabreicht wird, ist keine anaerobe Kultur oder Manipulation des therapeutischen Produkts erforderlich; die Zubereitung der Fäkaliensuspension an der Luft scheint ihre Wirksamkeit nicht zu beeinträchtigen. Die FMT scheint auch bei der Behandlung anderer entzündlicher Darmerkrankungen wirksam zu sein, und mehrere Forschungsgruppen sind damit beschäftigt, die Schlüsselkomponenten der fäkalen Mikrobiota zu bestimmen, die für die therapeutische Wirkung verantwortlich sind. Diese Forschung treibt den Übergang von einem schlecht charakterisierten fäkalen mikrobiellen Konsortium zu einem besser definierten, stabilen Produkt voran, das für eine langfristige Lagerung geeignet ist und rational ausgewählte Bakterienstämme enthält, die auf spezifische pathologische Zustände abzielen. Bei solchen Produkten werden die Umweltanforderungen an die benötigten Bakterienarten während der Entwicklung und Herstellung immer wichtiger. Eine anaerobe Atmosphäre ist eine solche Anforderung und kann erheblich zur Produktqualität beitragen. Daher werden anaerobe Arbeitsstationen von DWS jetzt bei der Manipulation von Fäkalienmaterial, mikrobiellen Konsortien und einzelnen Stämmen für die Herstellung neuartiger Therapien eingesetzt.  Dies unterscheidet sich deutlich von der Verwendung von Arbeitsstationen für herkömmliche Bakterienkulturen, da eine Erwärmung der Kammer auf eine Inkubationstemperatur nicht erforderlich ist und sogar unerwünscht sein kann.

Nachdem die aus Mikroorganismen gewonnenen Produkte die klinische Phase erreicht haben, wurden die rechtlichen Anforderungen für ihre Entwicklung und Anwendung festgelegt.  Die wichtigsten Arzneimittelzulassungsbehörden stufen diese Therapien als lebende biotherapeutische Produkte (LBP) ein und haben die für sie erforderlichen Qualitäts-, Sicherheits- und Wirksamkeitsdaten kodifiziert. Fast alle LBPs, die aus der Darmmikrobiota stammen, bestehen aus strikt anaeroben Bakterien, von denen einige (z. B. Faecalibacterium prausnitzii, Christensenella minuta) äußerst empfindlich auf geringe Sauerstoffkonzentrationen reagieren. DWS hat sich bemüht, eine Reihe von anaeroben Arbeitsstationen zu entwickeln, die sich für den Einsatz in der LBP-Entwicklung innerhalb des derzeitigen Rechtsrahmens eignen. Die Entwicklung von LBP beginnt mit der Isolierung, Anreicherung und Charakterisierung der potenziell therapeutischen Bakterienstämme, was mehrere Stufen der Kultur und Manipulation erfordert, bevor die erste Forschungszellbank (Research Cell Bank - RCB) erhalten wird. Die Qualitätsdokumentation in der RCB-Phase muss eine Beschreibung der Herkunft des Stammes (Material, aus dem der Stamm isoliert wurde) und seiner Kultur-/Passagegeschichte enthalten.  Es ist wichtig, die Reinheit der Bakterienkultur zu gewährleisten und das Einbringen von Verunreinigungen zu vermeiden. Dazu kann die anaerobe Kultur in einer Arbeitsstation mit HEPA-Filterung durchgeführt werden, um bakterielle und partikuläre Verunreinigungen aus der Inkubationsatmosphäre zu entfernen.

Das Management des Zellbanksystems für LBPs ist von entscheidender Bedeutung, da es den Wirkstoff des Produkts selbst enthält und dessen Qualität, Sicherheit und Wirksamkeit direkt beeinflussen kann. Nach einer umfassenden Charakterisierung des Stammes/der Stämme müssen die Masterzellbanken (Master Cell Banks - MCB) und die Arbeitszellbanken (Working Cell Banks - WCB) in einer GMP-Umgebung aus den RCB hergestellt werden. Um diesen Prozess zu ermöglichen, hat DWS eine Reihe von Laminar-Flow-Arbeitsstationen entwickelt, die eine streng anaerobe interne Atmosphäre in Kombination mit einigen der Funktionen eines pharmazeutischen Isolators bieten. Diese werden nun in GMP-konformen Prozessen eingesetzt, die anaerobe Verarbeitungsbedingungen erfordern, einschließlich der Manipulation von Zellbänken und der Verarbeitung von Fäkalienmaterial zur Herstellung von standardisierten Spenderfäkalienbänken in Form von gefrorenem oder lyophilisiertem Material.

Bei DWS wurde die Entwicklung von anaeroben Arbeitsstationen, die für den Einsatz in GMP-Umgebungen geeignet sind, durch Anfragen von potenziellen Kunden vorangetrieben, zunächst von solchen, die an der Einrichtung von Spenderfäkalienbanken als Quelle für standardisiertes, leicht verfügbares FMT-Material beteiligt sind. Wir haben jedoch auch wertvolle zusätzliche Informationen von den Mikrobiologen in unserem eigenen Labor erhalten. Als Reaktion auf den Anstieg der Entwicklung von LBPs, die von der Darmmikrobiota ausgehen, führten sie eine Reihe von Experimenten durch, um die Variabilität der Sauerstofftoleranz der in diesem Ökosystem vorkommenden Bakterien zu untersuchen. Konkret wurde die Sauerstoffempfindlichkeit potenzieller Krankheitserreger wie Bacteroides-, Clostridium- und Fusobacterium-Arten mit potenziellen therapeutischen Stämmen wie Roseburia, Alistipes und F. prausnitzii verglichen, die als ernährungsphysiologisch anspruchsvoll bekannt sind. Die Ergebnisse zeigten, dass jeder der potenziell therapeutischen Stämme eine hohe Intoleranz gegenüber atmosphärischem Sauerstoff aufweist, selbst bei 0,1 % v/v. Dies unterstreicht die Bedeutung strenger anaerober Bedingungen und Techniken für die Kultivierung und Manipulation solcher Stämme. Wir erhalten nach wie vor regelmäßig Anfragen zu geeigneten Kultivierungstechniken für die in jüngerer Zeit kultivierten Darmmikrobiota-Arten.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Verlagerung der Einsatzmöglichkeiten für anaerobe Kultivierungssysteme von der klinischen Diagnostik hin zu Biotherapeutika neben der Aufrechterhaltung strenger anaerober Bedingungen auch eine Reihe neuer Herausforderungen mit sich bringt. In der Vergangenheit war der Endpunkt der anaeroben Bakterienkultivierung die Entsorgung der Bakterien in einem Autoklav. Jetzt arbeiten wir darauf hin, den Patienten kultivierte Bakterien als eigenständige Therapie zu verabreichen.  Die Kultivierung anaerober Bakterien hat sich zu einem pharmazeutischen Herstellungsprozess entwickelt, der eine Übertragung und Skalierung der Prozesse vom Forschungslabor auf die Produktionsanlage erfordert.

Verfasser: Dr. Andrew Pridmore, Leiter der wissenschaftlichen Abteilung, Don Whitley Scientific Limited


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