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Zellkulturtechniken werden in vielen Bereichen der biomedizinischen Forschung eingesetzt, die von erheblicher Bedeutung für die menschliche Gesundheit sind, einschließlich der Krebsbiologie, der Stammzellforschung, der kardiovaskulären Biologie und der Neurowissenschaften.
In diesen verschiedenen Bereichen gibt es ein wachsendes Bewusstsein dafür, dass die In-vitro-Zellkultur unter Bedingungen durchgeführt werden sollte, die das in vivo-physiologische Umfeld so genau wie möglich nachahmen. Dies ist notwendig für die präzise Reproduktion von in vivo-zellulären Prozessen, da Zellen auf Umweltfaktoren auf unterschiedliche und komplexe Weise, sowohl metabolisch als auch morphologisch, reagieren.
Innerhalb des lebenden Gewebes von Menschen und anderen Säugetieren sind Zellen typischerweise Sauerstoffkonzentrationen im Bereich von 0,5 – 10% ausgesetzt, abhängig vom Gewebetyp – was deutlich niedriger ist als die 21% Sauerstoff in der Umgebungsluft. Allerdings erforderten Einschränkungen in der verfügbaren Ausrüstung zur atmosphärischen Kontrolle klassische Zellkulturtechniken, die eine Anreicherung von atmosphärischem CO₂ beinhalteten, während O₂ auf seinem Standardniveau in der Atmosphäre gehalten wurde. Dieser Ansatz zur In-vitro-Kultur bietet Bedingungen, die für die meisten Zelltypen als „hyperoxisch“ betrachtet werden können.
Die Kultur von Zellen unter normoxischen, „physiologisch angemessenen“ Bedingungen erfordert eine präzise Kontrolle von O₂, CO₂, Temperatur und Luftfeuchtigkeit. Ein Gerät, das entwickelt wurde, um diesen Bedarf zu erfüllen, ist der Zellkulturinkubator (oder „Tri-Gas“-Inkubator), der Luft mit CO₂- und N₂-Gasen mischt, um die erforderliche Atmosphäre zu erzeugen. Allerdings wird jedes Mal, wenn die Tür des Inkubators geöffnet wird, Sauerstoff hineingelassen, und die Zusammensetzung des atmosphärischen Gasgemisches wird vorübergehend gestört, sodass sie anschließend wiederhergestellt werden muss. Somit sind Zellen inkonsistenten, variablen Sauerstoffkonzentrationen ausgesetzt. Einige Tri-Gas-Inkubatoren verfügen über eine geteilte oder segmentierte Innenkammer mit einzelnen Türen, um die Störung der atmosphärischen Bedingungen zu minimieren, aber dies kann die Änderungen in den Gaskonzentrationen und der Temperatur, die auftreten, wenn Zellen zum Ernten oder zur periodischen Erneuerung des Kulturmediums aus dem Inkubator entfernt werden, nicht überwinden.
Wenn Zellen niedrigen Sauerstoffkonzentrationen ausgesetzt sind, wird eine Gruppe von physiologisch wichtigen Genen, wie Erythropoietin und vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor, induziert. Diese Gene werden durch den hypoxie-induzierbaren Faktor 1 (HIF-1) transkriptionell hochreguliert, ein globales Regulatorprotein, das aus α- und β-Untereinheiten besteht. Die Aktivität von HIF-1 wird hauptsächlich durch die hypoxie-induzierte Stabilisierung von HIF-1α bestimmt, das in Gegenwart von Sauerstoff schnell abgebaut wird. In den letzten Jahren wurden mehrere Rollen von HIF-1 in der Pathophysiologie verschiedener Krankheiten, einschließlich Krebs, nachgewiesen. Es ist ein entscheidender Mediator der hypoxischen Reaktion und Regulator des Sauerstoffstoffwechsels, was zur Tumorentwicklung und -progression beiträgt. Der HIF-1α-Ausdruck ist in Krebszellen hochreguliert und fördert das Tumorüberleben durch mehrere Mechanismen. Mehrere Verbindungen, die auf HIF-1-assoziierte Prozesse abzielen, werden inzwischen zur Behandlung verschiedener Krebsarten eingesetzt. Bei der Charakterisierung des Verhaltens von Tumorzellen und ihrer Reaktion auf diese Anti-Krebs-Verbindungen ist es entscheidend, unterbrochene hypoxische Bedingungen bereitzustellen, damit die in vivo-Experimentergebnisse die klinische Wirksamkeit genau vorhersagen können.
Jüngste Studien haben auch gezeigt, dass die Kultur unter kontinuierlichen Niedrigsauerstoffbedingungen positive Auswirkungen auf mesenchymale Stammzellen (MSCs) haben kann. Diese Stammzellen wurden als potenzielles Mittel zur Behandlung von Gewebeverletzungen, degenerativen Erkrankungen und Immunstörungen untersucht. Dies liegt an ihrer multipotenten Differenzierungsfähigkeit, immunmodulatorischen Effekten und angiogenen/neurogenen Eigenschaften. MSCs können aus verschiedenen Geweben isoliert werden, einschließlich Knochenmark, Fettgewebe, Nabelschnur und Zahnpulpa. Für sowohl Forschungs- als auch klinische Anwendungen ist die In-vitro-Kultur von MSCs erforderlich, um ausreichende Zellzahlen zu erhalten – jedoch sind langsame Wachstumsraten, frühe Seneszenz, DNA-Schäden und begrenzte Überlebensraten nach der Transplantation erhebliche Probleme in diesem Bereich. Eine hypoxische Umgebung kann die Wachstumskinetik und genetische Stabilität während der In-vitro-Expansion von MSCs erheblich verbessern und den Erfolg von MSC-basierten regenerativen Therapien fördern.
Die Vorteile der hypoxischen Inkubation wurden unter Verwendung von Zahnpulpa-Stammzellen (DPSCs) untersucht – einer einzigartigen Art von mesenchymalen Stammzellen (MSCs), die in vielen regenerativen Therapien vielversprechend sind. In einer Studie [8] wurde die ideale hypoxische Kulturumgebung für DPSCs mithilfe speziell gestalteter Kulturkammern innerhalb eines Tri-Gas-Inkubators bestimmt. Jede Kammer bestand aus einer Plastikbox, durch die stabile Mischungen von O₂, CO₂ und N₂ kontinuierlich injiziert wurden. Mit diesem System wurde das Wachstum von DPSCs in 21% O₂, 5% O₂ und 3% O₂verglichen, wobei die Autoren berichteten, dass 5% O₂ optimal für Wachstum, Stammzelleneigenschaften und die trophische Wirkung des Sekretoms (die Fähigkeit von bioaktiven Molekülen, die von DPSCs sekretiert werden, das Zellwachstum und die Regeneration zu fördern) war.
Die oben beschriebenen Studien zeigen, dass es möglich ist, eine hypoxische Umgebung für die Kultur und physiologische Untersuchung von Tumorzellen und Stammzellen zu schaffen, indem maßgeschneiderte Systeme auf der Grundlage konventioneller Zellkulturinkubatoren konstruiert werden. Die Entwicklung spezieller Hypoxie-Arbeitsplätze wie der Whitley Hypoxystation-Reihe hat jedoch eine bequemere, zugänglichere und präzisere Kontrolle von Sauerstoff, Kohlendioxid, Luftfeuchtigkeit und Temperatur ermöglicht, um kontinuierliche, ununterbrochene physiologisch relevante Bedingungen für die Zellkultur bereitzustellen. Insbesondere können routinemäßige Manipulationen, die für die Pflege kultivierter Zellen erforderlich sind, zusammen mit morphologischen, metabolischen und genomischen Untersuchungen unter denselben stabilen Bedingungen durchgeführt werden, die für die ursprüngliche Kultur verwendet wurden. Die Fähigkeit, kultivierte Zellen ohne Unterbrechung der Umweltbedingungen zu manipulieren, ist ein wichtiger Schritt, um sicherzustellen, dass experimentelle Ergebnisse das in vivo-Zellverhalten so genau wie möglich replizieren können.
Verfasst von DWS' Wissenschaftsleiter, Andrew Pridmore.
Referenzen:
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6. Qannita RA et al. (2024) Targeting Hypoxia-Inducible Factor-1 (HIF-1) in Cancer: Emerging Therapeutic Strategies and Pathway Regulation. Pharmaceuticals 17, 195. doi: 10.3390/ph17020195.
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